4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（o-PNPBG）如何用于检测β-葡萄糖苷酶？

来源：作者：人气：-发表时间：2017-12-12 16:40:00【大中小】

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Q: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（o-PNPBG）如何用于检测β-葡萄糖苷酶？

A: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷按以下规程用于β-葡萄糖苷酶检测，不过缓冲溶液可以配合受检的酶溶液的pH值进行调整。

所需材料:

缓冲溶液: - 0.1 M 醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0)。

酶底物溶液: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（10mM）。
称量301毫克的4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，加入150 ml耐热烧杯中，加入95毫升0.1M的醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0)。搅拌溶液直至底物全溶解（大约10分钟）。用0.1M的醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0)调节体积至100毫升。加入0.02 g叠氮钠以防止微生物污染。将溶液储存于一个密闭的Duran瓶中。日常使用时取10毫升加入聚丙烯试管中。注意不要频繁从酶底物储备液中取用。所有容器都应置于4摄氏度下储存。

酶制备液:
用GILSON的微量移液器精确将1.0毫升均匀的酶悬浮液转移到一个100毫升的容量瓶中，然后用0.1M的醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0)定容。接下来按照0.5毫升酶溶液和4.5毫升缓冲液的比例（10倍）稀释酶制备液，混合均匀，重复上述步骤直至获得适合分析的稀释液。

上述操作推荐使用Gilson移液器，预设0.5ml，用于转移酶制备液；Eppendorf多道移液器用于转移4.5ml缓冲液（5道设置为2.5毫升，4道设置为2毫升）。

检测过程:

40摄氏度下，预培养置于玻璃试管(16 x 100 mm)中的酶底物溶液（0.2毫升）5分钟

40摄氏度下，预培养酶稀释溶液（约5毫升）5分钟。

严格按时间间隔（大约15秒），往含有0.2毫升底物溶液的试管底部加入0.2毫升酶溶液，剧烈震荡混合试管内容物，然后培养试管（一式四份）10分钟左右。

培养结束前，加入3.0毫升2%的磷酸三钠溶液(pH 12.0)终止反应，并剧烈搅拌。

准备反应空白溶液（一式两份），将3.0毫升2%的磷酸三钠溶液(pH 12.0)加入0.2毫升底物溶液中，剧烈搅拌。然后加0.2毫升酶溶液，剧烈搅拌。

按以下步骤测量吸光度值(400 nm):

- 用蒸馏水校正分光光度计的零点
- 检测反应空白样相对于水的吸光度，并记录(仅供参考).
- 用蒸反应空白样校正分光光度计的零点
- 检测所有其它溶液相对于反应空白样的吸光度

活性计算公式如下:

1个单位酶活性，是每分钟在较佳pH和40摄氏度下将1微摩尔PNP底物水解成pNP和底物所需要的酶的数量。